РОДИКОР-ТЕСТ ВИЭВ инструкция по применению

Набор для дифференциальной диагностики вирусной диареи, рота- и коронавирусного энтеритов крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа.

Специфические иммуноглобулины, иммобилизованные на поверхности лунок полистироловой микропанели, связываются с гомологичными антигенами, присутствующими в исследуемом материале, образуя комплекс антиген-антитело. Полученный иммунный комплекс выявляется после взаимодействия с иммуноферментными коньюгатами (специфические иммуноглобулины, меченые пероксидазой хрена), фермент которого после добавления субстрата, вызывает разложение субстрат-индикаторного раствора и образование окрашенного продукта. Интенсивность окраски в лунке микропанели
пропорциональна содержанию специфического антигена в исследуемой пробе.

• дифференциальная диагностика вирусной диареи, рота- и коронавирусного энтеритов крупного рогатого скота.

Подготовка исследуемого материала

Для обнаружения антигена вируса диареи в качестве испытуемого материала используют слизистую носовой перегородки, миндалины, трахею, пораженные (изъязвления, воспаления) участки слизистой оболочки носа, носовой перегородки, фрагменты тонкого и толстого кишечника. От больных в острой стадии заболевания животных берут пробы носовой слизи при ринитах и фекалий при поносах.

Для обнаружения рота- и коронавирусных антигенов в качестве испытуемого материала используют фекалии, фрагменты тонкого и толстого кишечника.

Для получения 25-50% суспензии кусочки материала тщательно измельчают ножницами и растирают в фарфоровой ступке до образования однородной кашицеобразной массы. Вносят физиологический раствор. Полученную суспензию промораживают в течение 18-20 ч при - 20°С, оттаивают и осветляют центрифугированием при 4000 об./мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость сливают в стерильную посуду, инкубируют при 4°С в течение 2-3 ч и используют для исследования.

Для постановки ИФА необходимы одно- и многоканальные автоматические микропипетки разных объемов со сменными наконечниками, мерная лабораторная посуда, дистиллированная вода.

Подготовка компонентов набора для постановки реакции

Растворение компонентов реакции проводят на 0.01 М калий-фосфатном буфере (рН 7.2-7.4), для приготовления которого содержимое флаконов №11 (0.01 М калий фосфатный буфер) и №12 (натрий хлористый) растворяют в 1 дм³ дистиллированной воды и полученный фосфатно-буферный раствор (ФБР) хранят при 4-8 °С в течение месяца.

Содержимое ампул со специфическими (ротавирусным, коронавирусным, диарейным) антигенами растворяют в 0.1 см³ ФБР каждую, а с отрицательным - в 0.3 см³ ФБР.

Для промывания планшетов и разведения компонентов при постановке реакции готовят ТФБР: к 1 дм³ ФБР добавляют 0.5 см³ твин-20 или твин-80 (флакон №10) и перемешивают до полного растворения.

Содержимое ампул с иммуноферментными (ротавирусным, диарейным, коронавирусным) конъюгатами растворяют в 5 см³ ТФБР каждую.

Субстратную смесь готовят непосредственно перед использованием в реакции следующим образом: содержимое ампулы с 5-аминосалициловой кислотой (№8) растворяют в 10 см³ подогретой до 30-40°С дистиллированной воды, охлаждают и вносят в полученный раствор содержимое ампулы с гидроперитом (№ 9).

Постановка реакции

Реакцию проводят на планшете, сенсибилизированном иммуноглобулинами:

1-4 ряд - ротавирусные иммуноглобулины;

5-8 ряд - диарейные иммуноглобулины;

9-12 ряд - коронавирусные иммуноглобулины

На первом этапе реакции во все лунки планшета вносят по 0.1 см³ ТФБР. При качественной реакции (ответ "да" или "нет") в первые лунки 1-го, 5-го и 9-го рядов вносят по 0.1 см³ испытуемой пробы, пипетируют и 0.1 см³ раствора удаляют. В одну из лунок 4-го ряда таким же образом вносят ротавирусный антиген, в лунку 8-го ряда диарейный антиген, в лунку 12-го ряда - коронавирусныи антиген. Таким же образом вносят отрицательный антиген. При количественной постановке реакции пробы титруют методом двойных разведений с 1:2 до 1:256 на ТФБР. Планшет накрывают крышкой, инкубируют в термостате 1.5-2 ч при 36-37°С и затем отмывают лунки планшета от несвязавшихся антигенов следующим образом. Планшет освобождают от содержимого резким встряхиванием и трижды отмывают ТФБР, каждый раз полностью заполняя лунки буфером и вытряхивая содержимое. Затем микропанель подсушивают постукиванием по фильтровальной бумаге.

В отмытые лунки планшета с 1-го по 4-ый ряд вносят по 0.1 см³ ротавирусный иммуноферментный конъюгат, в лунки с 5-го по 8-ой ряд - диарейный иммуноферментный конъюгат по 0.1 см³, с 9-го по 12-ый ряд - коронавирусный иммуноферментный конъюгат по 0.1 см³, разведенные как указано выше, инкубируют в термостате при 36-37°С 1.5-2 ч и вновь четырежды отмывают раствором ТФБР.

Затем в лунки вносят по 0.1 см³ субстратной смеси, которую готовят непосредственно перед использованием в реакции.

Учет результатов

Результаты реакции учитывают через 40-60 мин проводя измерение оптической плотности (О.П.) раствора в каждой лунке на спектрофотометре (ридере) с вертикальным лучом света при длине волны 405 нм.

На первом этапе вычисляют показатель О.П. каждой испытуемой и контрольной пробы.

Результаты считают достоверными, если О.П. положительного контроля ≥ 0.4, а О.П. отрицательного контроля ≤0.2.

Реакцию оценивают по отношению значения О.П. испытуемой пробы (S) к значению О.П. положительного контроля (Р) по формуле:

S/P = О.П. испытуемой пробы × 100/О.П. положительного контроля

Пробу считают положительной, если значение S/P > 48%; если значение S/P < 48% - проба считается отрицательной.

При отсутствии ридера проводят визуальный учет результатов реакции по появлению окраски образовавшегося реакционного продукта по сравнению с контролями от коричневого до светло-коричневого цвета:

• интенсивное коричневое окрашивание, коричневое окрашивание - положительный результат;
• светло-коричневое окрашивание - сомнительный результат;
• окрашивание отсутствует или находится на уровне отрицательного контроля - отрицательный результат.
• окрашивание отсутствует или находится на уровне отрицательного контроля - отрицательный результат.

При отсутствии маркировки (этикеток, нарушении целостности ампул, флаконов), изменении цвета и консистенции содержимого, наличии хлопьев и посторонних примесей при растворении, а также при неполном растворении, компоненты бракуют.

Меры личной профилактики

При использовании набора необходимо соблюдать правила техники безопасности. Во избежание порезов осторожно вскрывать ампулы, входящие в набор.

Использованные микропанели дезинфицируют раствором хлорамина или другими сильными окислителями.

Запрещается прием пищи и воды, курение в помещении, где проводятся работы с компонентами набора.

Набор следует хранить в сухом, темном, недоступном для детей месте при температуре 4-8°С.

Утилизация наборов, не прошедших контроль, а также с истекшим сроком годности не требует специальных мер предосторожности.

Помогите другим с выбором, оставьте отзыв об РОДИКОР-ТЕСТ ВИЭВ