РОТА-ИФА ВИЭВ инструкция по применению

Набор для диагностики ротавирусного энтерита крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа.

Принцип метода заключается в следующем: специфические иммуноглобулины, иммобилизованные на поверхности лунок полистироловой микропанели, связываются с гомологичными антигенами, присутствующими в исследуемом материале, образуя комплекс антиген-антитело. Полученный иммунный комплекс выявляется после взаимодействия с иммуноферментным коньюгатом (специфические иммуноглобулины, меченые пероксидазой хрена), фермент которого, после добавления субстрата, вызывает разложение субстрат-индикаторного раствора и образование окрашенного продукта. Интенсивность окраски в лунке микропанели пропорциональна содержанию специфического антигена в исследуемой пробе.

• диагностика ротавирусного энтерита крупного рогатого скота.

Подготовка исследуемого материала

Для обнаружения ротавирусного антигена, в качестве испытуемого материала используют фекалии больных телят, а также фрагменты тонкого и толстого кишечника павших животных. Для получения 25-50%-ной суспензии кишечника кусочки материала тщательно измельчают ножницами и растирают в фарфоровой ступке до образования однородной кашицеобразной массы, вносят физиологический раствор. Полученную суспензию промораживают в течение 18-20 ч. при минус 20°С, оттаивают и осветляют центрифугированием при 4000 об./ мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость сливают в стерильную посуду и используют для исследования.

Подготовка компонентов набора для постановки реакции

Для постановки ИФА необходимы одно- и многоканальные автоматические микропипетки разных объемов со сменными наконечниками, мерная лабораторная посуда, дистиллированная вода.

Растворение компонентов реакции проводят на 0.01 М калий-фосфатном буфере (рН 7.2-7.4), для приготовления которого содержимое флаконов № 7 (0.01 М калий фосфатный буфер) и №8 (натрий хлористый) растворяют в 2 дм³ дистиллированной воды и полученный фосфатно-буферный раствор (ФБР) хранят при 4-8°С в течение месяца при
необходимости.

Содержимое ампул со специфическим ротавирусным (№1) и отрицательным (№2) антигенами растворяют в 0.2 см³ ФБР каждую.

Для промывания планшетов и разведения компонентов при постановке реакции готовят содержащий твин фосфатно-буферный раствор (ТФБР): к 2 дм³ ФБР добавляют 1.0 см³ твин-20 или твин-80 (флакон №6) и перемешивают до полного растворения.

Содержимое ампул с иммуноферментным ротавирусным коньюгатом (№3) растворяют в 10 см³ ТФБР.

Субстратную смесь готовят непосредственно перед использованием в реакции следующим образом: содержимое ампулы с 5-аминосалициловой кислотой (№4) растворяют в 10 см³ подогретой до 30-40°С дистиллированной воды, охлаждают и вносят в полученный раствор содержимое ампулы с гидроперитом (№5).

Постановка реакции

На первом этапе реакции во все лунки планшета вносят по 0.1 см³ ТФБР. В первую лунку 1-го ряда плашки вносят 0.1 см³ специфического антигена, в первую лунку 2-го ряда - 0.1 см³ отрицательного антигена, а в первые лунки последующих рядов вносят по 0.1 см³ исследуемых антигенов и готовят их двукратные разведения, начиная с 1:2 до 1:128 на ТФБР. При качественной реакции (ответ "есть" или "нет") постановку осуществляют аналогично, но материал не титруют, а делают не менее трех повторностей с разведением испытуемой пробы 1:2. Содержимое лунок тщательно перемешивают пипетированием в течение 5-7 сек., инкубируют 1.5-2 ч при 36.5-37.5°С и 3-4 раза отмывают ТФБР лунки плашки от несвязавшихся антигенов.

Содержимое ампулы с иммуноферментным коньюгатом вносят по 0.1 см³ во все отмытые лунки плашек, инкубируют при 36.5-37.5°С 1.5 ч и вновь четырежды отмывают раствором ТФБР.

Затем во все лунки вносят по 0.1 см³ субстратной смеси, которую готовят непосредственно перед использованием в реакции.

Учет результатов

Результаты реакции учитывают через 40-60 мин, проводя измерения оптической плотности (О.П.) раствора в каждой лунке на спектрофотометре (ридере) с вертикальным лучом света при длине волны 405 нм.

На первом этапе вычисляют показатель О.П. каждой испытуемой и контрольной пробы.

Результаты считают достоверными, если О.П. положительного контроля ≥ 0.4, а О.П. отрицательного контроля ≤ 0.2.

Реакцию оценивают по отношению значения О.П. испытуемой пробы (S) к значению О.П. положительного контроля (Р) по формуле:

S/P = О.П. испытуемой пробы × 100/О.П. положительного контроля

Пробу считают положительной, если значение S/P > 48%; если значение S/P < 48% - проба считается отрицательной.

При отсутствии ридера проводят визуальный учет результатов реакции через 40-60 мин по появлению окраски образовавшегося реакционного продукта по сравнению с контролями от коричневого до светло-коричневого цвета:

• интенсивное коричневое окрашивание, коричневое окрашивание - положительный результат;
• светло-коричневое окрашивание - сомнительный результат;
• окрашивание отсутствует или находится на уровне отрицательного контроля - отрицательный результат.

При нарушении целостности и укупорки ампул (флаконов), изменении цвета содержимого, наличии плесени и посторонних примесей во флаконах, при отсутствии этикеток на компонентах набора, а также в случае неиспользования в пределах срока годности, неспецифические компоненты набора выбраковывают, а иммуноспецифические компоненты обеззараживают кипячением в течение 15 мин.

Неиспользованные микропланшеты дезинфицируют в 3% растворе хлорамина. Рабочую поверхность стола и руки обрабатывают 0.5% раствором хлорамина.

Меры личной профилактики

Лица, участвующие в проведении исследований, должны соблюдать правила общей и личной гигиены, надевать халаты, колпаки. Во время работы запрещается принимать пищу, пить воду, курить.

При попадании компонентов диагностикума на открытые участки тела или слизистую оболочку глаз, рта, носа их тщательно промывают водопроводной водой с мылом.

При использовании набора необходимо соблюдать правила техники безопасности. Во избежание порезов осторожно вскрывать ампулы, входящие в набор.

Набор следует хранить в сухом, защищенном от света, недоступном для детей месте при температуре 4-8°С.

Утилизация неспецифических компонентов набора не требует специальных мер безопасности.

Помогите другим с выбором, оставьте отзыв об РОТА-ИФА ВИЭВ